Clodronate Liposomes如何使用的相關問題解答

    2018年蘇州螞蟻淘生物科技有限公司正式成為Clodronate liposomes的授權代理商，負責該公司巨噬細胞清除試劑在中國大陸的市場和銷售工作，此前使用的是陳舊的資料，今天螞蟻淘重新整理了一份Clodronate liposomes說明書，以FAQS的形式展示如下：



1、是否有可能在體外使用氯膦酸脂質體清除巨噬細胞?

    是的，在體外消耗巨噬細胞是可能的，但請記住，這種方法特別適用于“體內(nèi)”研究。原因是Clodronate從死qu的巨噬細胞釋放或泄漏培養(yǎng)基中發(fā)布的脂質體(依賴于介質的組成)不能逃離媒介而Clodronate,一旦“體內(nèi)”發(fā)布,半衰期很短,由于其快速切除腎臟。游離氯膦酸鹽分子不容易進入細胞，因為它們很難通過細胞膜(以及脂質體磷脂雙層膜)。然而，如果它們留在周圍的培養(yǎng)基中，它們可能會慢慢積累成細胞。

    參見參考文獻Claassen, I., Van Rooijen, N., and Claassen, E., 1990. A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogenous cell populations ‘in vitro’, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. J. Immunol. Meth.. vol. 134. pp. 153-161. (#32).

 

2、清除肺泡巨噬細胞如何給藥？

    脂質體既可經(jīng)鼻給藥，也可經(jīng)氣管給藥。

    參見參考文獻：DeHaan, A., Groen, G., Prop, J., Van Rooijen, N., Wilschut, J. 1996. Mucosal immunoadjuvant activity of liposomes: Role of alveolar macrophages. Immunology, 89; 488-493)
The difference may be that all liposomes once admiNISTered intratracheally, arrive in the lung (alveoli), whereas liposomes admiNISTered intranasally (if admiNISTration is not well performed

 

3、動物注射氯膦酸脂質體后死亡的原因？

    A、動物在注射過程中死亡

    這可能是由于注射了非均勻懸浮的脂質體。

    為了得到均勻的懸浮體，在注射前應搖動或攪拌脂質體的懸浮體。一段時間后脂質體會沉淀。如果注射時間太長，它們甚至可能沉淀在注射器中，如果更多的動物使用相同的注射器注射，這也可能導致不同的劑量，因為個動物將得到更多的(部分沉淀)脂質體比后一個動物。

    另一個原因可能是注射過快。如果從冰箱中取出脂質體，它們至少應該有時間達到室溫。

    B、動物在注射幾天之后死亡

    這可能是由于微生物污染和/或在注射前不久或注射期間激活動物造成的。請記住，巨噬細胞的缺失可能導致病毒滴度、細菌或酵母菌的增加。

 

4、脂質體標簽如何應用？

    對照脂質體可能被標記，例如用熒光染料DiI，因為它們不影響巨噬細胞。因此，該標簽將顯示組織內(nèi)脂質體的分布模式及其被巨噬細胞攝取。我們通常不發(fā)送帶有DiI標記的氯膦酸脂質體，原因如下:氯膦酸脂質體會殺死巨噬細胞;因此，一旦巨噬細胞死亡，DiI標簽將被重新輻射，而該標簽不再代表脂質體的實際分布。因此，脂質體要么含有氯膦酸鹽來消耗巨噬細胞，要么含有DiI來顯示哪些巨噬細胞正在吞噬脂質體(或者脂質體是否能夠到達待研究的巨噬細胞)。組合可能導致誤解。

 

材料：

PBS:磷酸0012;0,8% NaCl, pH 7,4

 

DiI的解決方案:

將1ml乙醇100%添加到2,5 mg DiI(分子探針文章編號D-3911)在35千赫的水浴中超聲1分鐘(嵴應溶解)

 

方法：

每毫升脂質體懸浮液中加入10微升DiI溶液；

*搖動脂質體懸浮液；

室溫(黑暗)孵育10分鐘；

以20.000 xG離心脂質體10分鐘；

移除上層清液；

加入無菌PBS，復蘇；

以20.000 xG離心脂質體10分鐘；

將無菌PBS添加到原始卷中；

在4攝氏度的溫度下儲存標記為黑色的脂質體

 

5、

    A1。大鼠成熟巨噬細胞對ed1和ed2呈陽性。然而，它們的前體沒有表現(xiàn)出吞噬作用(直接離開骨髓后)或很少的吞噬作用(在它們擴散到成熟巨噬細胞前不久)也是陽性的。這些前驅體對e。2是負的。因此，ed2 +細胞會*耗盡，但ed1 +細胞只會部分耗盡。ED1+消耗的百分比取決于前體/成熟巨噬細胞的實際比例，由于新前體的補充，可能在以后的時間間隔內(nèi)發(fā)生改變。

 

6、失敗的表現(xiàn)？

    請注意，氯膦酸酯脂質體和對照脂質體都是大批量生產(chǎn)的。這些母批得到一個*的代碼，并檢查氯膦酸鹽的含量和可能的污染后的準備。這些批次的樣品被送往世界各地的幾個(ca 30)不同的實驗室。因此，如果我們收到一封電子郵件，報告與脂質體缺乏活性或污染有關的問題，我們將檢查是否有其他來自實驗室的投訴，這些實驗室確實收到了與發(fā)給您的樣品相同批次的樣品。如果沒有，我們當然會盡快通知您未來的投訴將到達我們。

    它們失效的具體地理相關原因可能是運輸或儲存期間的溫度造成的。脂質體在運輸或儲存過程中，任何時候都不應冷凍或加熱至攝氏30度以上。

    此外，在選擇給藥途徑時，應確保脂質體能夠暢通無阻地接近即將耗盡的吞噬細胞(見參考資料一章)。請記住，脂質體是顆粒，不會穿過正常毛細血管內(nèi)皮。

    此外，巨噬細胞的特異性標記物也需要從組織中確定它們的消耗。非特異性標記的使用可能影響結果的可靠性。

 

7、如何處理氯膦酸脂質體和控制脂質體？

    氯膦酸脂質體和對照脂質體的懸浮液應按原樣使用，不應稀釋或進行任何其他處理。如果在到達后的幾天內(nèi)不使用，可以將其保存在攝氏4度。從未凍結脂質體! !

    脂質體(作為顆粒)容易沉淀。因此，在將懸浮液分成更小的體積或注射到動物體內(nèi)之前，應輕輕搖動懸浮液，以便再次獲得均勻的懸浮液，并使脂質體在整個懸浮液中均勻分布。如果儲存在4攝氏度，脂質體應該有機會達到室溫之前注射。永遠不要注射冷脂質體!

 

8、增加氯膦酸脂質體的濃度

    A、

    不，氯膦酸鹽在脂質體內(nèi)的水艙中的濃度受氯膦酸鹽溶解度的限制，在標準的氯膦酸鹽脂質體懸浮液中保持大濃度。

    B、

    這是不推薦靜脈注射，因為流動性會降低，這可能導致堵塞毛細血管。然而，它也可以嘗試，例如在松散編織的組織中局部注射，或在脂質體逐漸進入循環(huán)之前從脂質體被過濾的腹腔內(nèi)注射。

    C、如何確定用量？

    靜脈注射每10克體重不應超過0.1毫升。然而，腹腔內(nèi)注射時，注射量可大大增加。對于皮下注射，大注射量取決于注射部位的儲存能力。

    D、

    Clodronate體內(nèi)的半衰期是以來的15分鐘,是很有區(qū)別的注射高劑量的免費Clodronate,這將減少到一半的原始值每15分鐘,注射相同劑量的脂質體將從死qu的巨噬細胞釋放緩慢。

    在種情況下，有一個高濃度，將迅速減少。在第二種情況下，濃度要低得多，但可以維持更長的時間。

 

9、巨噬細胞的長期消耗

    在正常情況下，即在沒有某些微生物產(chǎn)物激活的情況下，巨噬細胞群，如肝臟中的庫普弗細胞和脾臟中的紅髓巨噬細胞，在約1周后開始重新填充它們的隔室。

    其他巨噬細胞群，如脾臟邊緣嗜金屬巨噬細胞和邊緣區(qū)巨噬細胞(靜脈注射后)和淋巴結巨噬細胞(引流區(qū)皮下注射后)在較長時間內(nèi)都不存在(見相關文獻底稿)。

    為了實現(xiàn)SCID小鼠巨噬細胞的長期耗竭，F(xiàn)raser等人(Blood, 86;嘗試了幾種注射方案，其中，一次未稀釋的氯丙酸脂質體注射后，隨后每5-7天稀釋一次氯丙酸脂質體。

    然而，我們應該記住巨噬細胞調(diào)節(jié)各種非吞噬細胞的功能。因此，它們的長期缺失可能終導致功能不活躍，甚至這些非吞噬細胞的消失。

 

10、巨噬細胞前體(單核細胞)

    而靜脈注射Clodronate脂質體沒有成熟的巨噬細胞如腸道,由于脂質體不能跨毛細血管的血管內(nèi)皮,Galeazzi et al . (Am J. Physiol. 278 G259-G265, 2000, 見還在手稿)描述的影響通過靜脈注射Clodronate脂質體的炎癥誘導招聘和滲透F4/80陽性細胞的小鼠空腸。關于這個問題，以下幾點很重要:巨噬細胞(單核細胞)的前體被招募到例如炎癥區(qū)域，循環(huán)中的氯膦酸脂質體似乎耗盡了。在這種情況下，幾次注射氯膦酸脂質體后不久，必須給予對方，因為1。脂質體在循環(huán)中存活時間不長。相對于成熟的巨噬細胞，新的單核細胞可以在較短的時間內(nèi)被招募。在Galeazzi等人的研究中，給予氯膦酸酯脂質體4小時。在感染前、感染后1、2、4天內(nèi)，應保證盡可能多地消耗所招募的前體。-顯然，他們得到了大量的，在他們的情況下，也有足夠的損耗，但幾乎*的損耗從來沒有報告過。-在更多的研究中，氯膦酸脂質體的作用只能通過假設在循環(huán)或單核/內(nèi)皮相互作用水平上對巨噬細胞前體的作用來解釋。關于血腦屏障(BBB)，后者的作用可能是通過將甘露糖殘基摻入含脂質體的氯膦酸鹽中來介導的，Huitinga等(J. Exp. Med. 172; 1025-1033, 1990）描述了甘露醇酯類氯膦酸脂質體在實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)模型中的作用。——然而在Clodronate脂質體的研究多次(每周2次)和靜脈注射給正常小鼠,成熟的巨噬細胞在各種器官血管障礙防止直接進入成熟的巨噬細胞,并沒有耗盡即使在一個月之后,強調(diào)單核細胞維持正常營業(yè)額招募巨噬細胞在這些器官,沒有受到明顯影響。

 

    請同時參閱新聞部分:

Blood monocytes (the precursors of mature resident macrophages) can be depleted by intravenous injection of Clodronate liposomes.
In: J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4410-7.
Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.
by: Sunderkotter C, Nikolic T, Dillon MJ, Van Rooijen N, Stehling M, Drevets DA, Leenen PJ.

 

11、生產(chǎn)及裝運時間表？

    訂單在周一、周二和周四發(fā)貨。通過電子郵件發(fā)送的采購訂單可能需要幾天的時間來處理。

    在此之后收到的訂單早將于下周發(fā)貨。盡管我們通常準備的脂質體懸浮液比滿足所有要求所需的多一點，但我們每周的生產(chǎn)計劃都是根據(jù)這些要求制定的。

    如果你想確定脂質體的存在，當你在進行中的實驗中需要這些時，你應該至少提前兩周訂購。更好的方法是在脂質體已經(jīng)儲存在冰箱里的時候開始實驗。雖然我們通常每周發(fā)貨，但疾病或其他不可預見的情況可能會打斷這個過程!

    如果您的訂單在 2周內(nèi)沒有到達，有兩個主要原因。

1. 該包裹被您的組織拒絕，因為您的名字不為內(nèi)部分發(fā)郵件的人所知，或者您的地址不完整。

2. 另一個人已經(jīng)接受了這個包裹，但沒有告訴你這件事。如果這種情況不止一次發(fā)生，你的賬戶就會被封，直到一切都解決了，因為太多的時間和材料都因為這些原因被破壞了。